騎士團(tuán)直到1530年才擁有自己的領(lǐng)土，當(dāng)時(shí)大團(tuán)長(zhǎng)菲利普·德·維利耶（Fra' philippe de Villiers de l'Isle Adam）占領(lǐng)了馬耳他島（malta）。
該島是由神圣羅馬皇帝查理五世和他的母親卡斯蒂利亞女王瓊娜（queen Joanna of castile）以西西里國(guó)王的身份授予騎士團(tuán)的，得到了教皇克萊門特七世（pope clement VII）的批準(zhǔn)，騎士團(tuán)因此需遵守《馬耳他獵鷹的貢品》（trif the maltese Falcon）的條件。
在1565年，騎士們?cè)诖髨F(tuán)長(zhǎng)讓·德·瓦萊特（Fra' Jean de Valette，曾在土耳其船上和德拉古特一起劃槳）的領(lǐng)導(dǎo)下，成功防御了奧斯曼帝國(guó)的圍攻，持續(xù)了三個(gè)多月。
騎士團(tuán)的艦隊(duì)在1571年的萊班托海戰(zhàn)（）中對(duì)奧斯曼海軍力量的最終摧毀做出了貢獻(xiàn)，該戰(zhàn)役由西班牙國(guó)王菲利普二世（King philip II of Spain）的異母兄弟奧地利的約翰（John of Austria）指揮。
宗教改革將西歐分裂為新教和天主教國(guó)家，對(duì)騎士團(tuán)也產(chǎn)生了影響。
在包括英格蘭、蘇格蘭和瑞典在內(nèi)的多個(gè)國(guó)家，騎士團(tuán)解散。
在其他國(guó)家，如荷蘭和德國(guó)，部分司法區(qū)或指揮部（騎士團(tuán)的行政區(qū)劃）經(jīng)歷了新教轉(zhuǎn)變。
這些“約翰騎士團(tuán)”在德國(guó)、荷蘭、瑞典以及包括美國(guó)和南非在內(nèi)的許多其他國(guó)家存續(xù)下來(lái)。
騎士團(tuán)被確立為在任何基督教國(guó)家之間的戰(zhàn)爭(zhēng)中保持中立。
從1651年到1665年，騎士團(tuán)統(tǒng)治了加勒比海的四個(gè)島嶼。
在1651年5月21日，它購(gòu)買了圣巴瑟米島（Saint barthélemy）、圣基督山（Saint christopher）、圣克魯瓦島（Saint croix）和圣馬丁島（Saint martin）。
這些島嶼是從剛剛解散的法國(guó)外島公司（pagnie des ?les de l'Amérique）手中購(gòu)買的。
到1665年，這四個(gè)島嶼被出售給了法國(guó)西印度公司（French west India pany）。
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1798年，拿破侖領(lǐng)導(dǎo)法國(guó)占領(lǐng)馬耳他。
拿破侖要求大團(tuán)長(zhǎng)費(fèi)迪南德·馮·霍姆佩施·祖·博爾海姆（Ferdinand von hompesch zu lheim）允許他的艦船進(jìn)入港口，補(bǔ)給水和物資。
大團(tuán)長(zhǎng)回復(fù)說(shuō)，每次只能允許兩艘外國(guó)船只進(jìn)入港口。
拿破侖意識(shí)到這一程序?qū)⒑馁M(fèi)時(shí)間，令他的軍隊(duì)暴露在英國(guó)海軍上將霍雷肖·納爾遜（Admiral horatio Nelson）面前，于是立即下令對(duì)馬耳他發(fā)起炮擊。
法國(guó)士兵于6月11日早晨在七個(gè)登陸點(diǎn)登陸馬耳他并發(fā)動(dòng)攻擊。
經(jīng)過(guò)數(shù)小時(shí)的激烈戰(zhàn)斗，西部的馬耳他人被迫投降。
拿破侖與堡壘首都瓦萊塔（Valletta）展開(kāi)談判。
面對(duì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于自己的法國(guó)軍隊(duì)和西馬耳他的失守，大團(tuán)長(zhǎng)同意投降。
霍姆佩施于6月18日離開(kāi)馬耳他前往的里雅斯特（trieste）。
他于1799年7月6日辭去大團(tuán)長(zhǎng)職務(wù)。
騎士們雖然分散，但騎士團(tuán)依然以減弱的形式存在，并與歐洲各國(guó)政府談判，尋求在德意志中介化過(guò)程中重新獲得權(quán)力。
俄羅斯皇帝保羅一世（paul I）為最多騎士提供了在圣彼得堡（Saint peters）的庇護(hù)，這一舉動(dòng)催生了俄羅斯的騎士醫(yī)院傳統(tǒng)，以及騎士團(tuán)在俄羅斯帝國(guó)騎士團(tuán)中的認(rèn)可。
在圣彼得堡的難